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胞外酶可以直接进行提取分离;胞内游离存在的“离酶”以及与颗粒体(如细胞核、线粒体、微粒体、质膜)结合的“结酶”都有一个破碎细胞过程，“结酶”还有一个转变成水溶液的问题。因此对酶类的提取要采用多种方法，常用的细胞破碎法如下：
机械法：如绞碎、刨碎、匀浆、研磨、挤压或超声波等。研磨时还可加入细砂、石英粉、氧化铝等以利细胞破碎。
化学法：用盐、碱、表面活性剂、EDTA、丙酮和正丁醇等可使细胞破碎、颗粒体结构解体，从而把酶释放出来。例如常将胰脏用数倍量丙酮处理2～3次，制成丙酮粉供多种酶的提取用;用胆酸盐处理膜结构上的脂蛋白和“结酶”，使两者形成复合物，并带上静电荷，由于电荷之间的排斥作用，使膜破裂，达到溶解。
酶解法：用组织自溶或用溶菌酶、脱氧核糖核酸酶、磷脂酶等降解细胞膜结构，然后再进行提取。但应知道组织自溶法对某些酶的提取是不利的，如胰蛋白是以酶原形式纯化后再激活成胰蛋白酶的，若用自溶法提取，酶原已转成酶，纯化就很困难。而用纯的工具酶降解法是无此缺点，但成本较高。
冻融法：采用反复冷冻与融化时由于细胞中形成了冰晶及剩余液体中盐浓度的增高可以使细胞破裂。
酶的提取溶剂可以用水、一定浓度的乙醇、乙二醇、丁醇和稀盐溶液、缓冲溶液等;也可以用稀碱或稀酸溶液，如用稀硫酸提取胰蛋白酶，用稀盐酸提取胃蛋白酶。溶剂用量一般为原料重量的1～5倍。搅拌可加速提取，但转速不宜太快，否则会产生泡沫而难以过滤或使酶变性。多数酶的提取要在50C以下操作，但有的酶在较高温度下提取更好，如胃蛋白酶在450C提得收率较高，一般可在一5～+400C间适当选择。提取液的pH应在酶的稳定pH范围内，并应远离其等电点的pH为宜，如蛋白酶选用pH2.5～3，0，胰蛋白酶和α一糜蛋白酶则用0.25 N硫酸提取。若在中性或碱性提取时，最常用的是0.15 mol/L氯化钠、0.02～0.05mol/L磷酸缓冲液、0.02-0.05mol/L焦磷酸缓冲液。正丁醇的亲脂性强，能透入酶的脂质结合物中，又兼有亲水性，有类似表面活性剂的作用，适用于提取“结酶”。
为了减少提取液体积，可用多段逆流提取或柱型抽提法。液渣分离可用过滤法(如板框压滤、旋转真空过滤)或离心法。过滤时可加硅藻土、纸浆等为助滤剂。离心时可加入氢氧化铝凝胶、磷酸钙凝胶等以除去悬浮的胶体物质。
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