【摘要】 目的：研究外源性TGF?β对肝星状细胞系（HSC?T6）的激活作用，以及积雪草酸抑制HSC?T6细胞Ⅰ型胶原蛋白合成的药理作用。 方法：用LDH和MTT实验测定积雪草酸对HSC?T6细胞的细胞毒性和细胞增殖的影响。 检测HSC?T6细胞受不同剂量和不同时间TGF?β刺激后表达Ⅰ型胶原蛋白的最佳剂量和时间。 以不同剂量的积雪草酸作用于TGF?β活化的HSC?T6细胞，提取细胞总蛋白，以Western Blot方法检测积雪草酸对TGF?β活化的HSC?T6细胞Ⅰ型胶原蛋白表达的影响。 结果：TGF?β刺激HSC?T6细胞表达Ⅰ型胶原蛋白的最佳剂量为1 ng/mL，最佳时间24 h. 10～30 μmol/L积雪草酸可以抑制TGF?β诱导的HSC细胞Ⅰ型胶原蛋白表达。 结论：外源性TGF?β可激活HSC?T6细胞表达Ⅰ型胶原蛋白；积雪草酸抑制HSC?T6细胞Ⅰ型胶原蛋白表达。

　　【关键词】 积雪草酸； Ⅰ型胶原蛋白； HSC?T6细胞； 转化生长因子?β

　　0引言

　　传统中药积雪草具有促进伤口愈合和抑制瘢痕增生药效［1-2］。 新近的研究表明积雪草能够抑制瘢痕组织来源的成纤维细胞的增殖和纤维蛋白的合成［2］。 肝星状细胞在肝纤维化过程中起着至关重要的作用。 本研究以积雪草酸作用于SV40病毒大T抗原转化的肝星状细胞（HSC?T6），研究积雪草酸对HSC?T6细胞胶原蛋白合成的影响。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　积雪草酸（SIGMA， Cat： 546712）， 黄棕色粉末， 无臭， 味苦。 分子式为C48H78O5， 熔点325℃～330℃，不溶于水，溶于二甲亚砜（DMSO）， 储存液浓度20 mmol/L. TGF? β1（R%26amp;D Systems， Cat 240?B），储存液浓度10 mg/mL. HSC?T6由纽约Mount Sinai医学院 Friedmen教授赠送，维持培养在低糖型DMEM（Invitrogen）培养基中，添加10 g/L青链霉素（Invitrogen）和100 mL/L胎牛血清（Hyclone）。 1×105细胞2.5 mL铺6孔培养板， 50 mL/L CO2， 37℃ 培养24 h，换含2 mL/L胎牛血清DMEM继续培养24 h. TGF?β剂量实验组分别加入0.1， 0.5， 1， 2， 5 ng/mL TGF?β，培养24 h后收取细胞蛋白；TGF?β时间实验中各组均同样加入1 ng/mL TGF?β，分别在0， 6， 1， 24， 48 h收取细胞蛋白；积雪草酸实验分别加积雪草酸 0， 5， 10， 20， 30 μmol/L，2 h后除空白对照孔外，各孔加1 ng/mL TGF?β，24 h后提取细胞蛋白。

　　1.2方法

　　1.2.1乳酸脱氢酶细胞毒性实验（LDH）

　　LDH试剂盒购自SIGMA公司。 HSC?T6细胞维持培养在100 mL/L胎牛血清、10 g/L青链霉素的DMEM中。 1×105 HSC?T6铺96孔板，细胞连续性达70％，吸弃上清，无血清DMEM 200 μL 洗2次。 2 mL/L胎牛血清DMEM中加入积雪草酸或DMSO，浓度分别为2.5， 5， 10， 20， 30， 40， 60， 80 μmol/L，200 μL加入细胞培养孔， 20 g/L Triton?100作阳性对照，2 g/L胎牛血清DMEM作阴性对照，每剂量组各为3孔，37℃，50 mL/L CO2培养24 h. 将每孔上清吸出置另一96孔板相应孔，2000 r/min， 5 min待测。 将原各孔中残余液体吸干净，加入含20 g/L Triton?100的DMEM 200 μL， 37℃，50 mL/L CO2培养30 min，使细胞裂解，2000 r/min， 5 min. 按试剂盒操作说明检测上清中以及细胞内的LDH，以490 nm波长测定A值，LDH释放率=A上清/（A上清+A细胞内）×100%.

　　1.2.2细胞增殖活性实验（MTT）

　　HSC?T6细胞培养方法以及积雪草酸处理浓度和对照组的设置均与LDH检测方法中描述的相同。 MTT检测试剂购自Promega公司。 加入MTT染液在37℃培养4 h， 加入溶解液室温过夜，测定A570 nm/A650 nm双波长的吸光度。

　　1.2.3蛋白质提取及定量用RIPA（10 g/L Nonidet P?40， 1 g/L SDS， 1 mmol/L PMSF， 5 g/L sodium deoxycholate， 1 mmol/L sodium orthovanadate， 10 mmol/L sodium fluoride in PBS）

　　细胞蛋白裂解液250 μL，将6孔板每孔中的细胞蛋白收集至1.5 mL离心管管中，超声粉碎500 W， 3 s×6次，以4℃， 10 000 r/min离心10 min，收取上清。 细胞蛋白浓度测定按照Bio?Rad Laboratories蛋白测定试剂盒（Cat500?0113）说明书来操作。 用RIPA裂解液将蛋白调节为一致浓度后，加入等体积的2×SDS上样缓冲液（100 mmol/L Tris.HCl， 40 g/L SDS，200 g/L甘油，2 g/L bromophenol blue）。 100℃蛋白变性5 min备用。

　　1.2.4免疫印记40 mL/L积层胶，100 mL/L分离胶，总蛋白20 μg的样本，加样至100 mL/L SDS?PAGE中电泳100 V，90 min. 然后将蛋白转移至PVDF膜，150 V，90 min. 转膜后TBST洗膜。 以50 mL/L脱脂奶粉?TBST封闭液室温下封闭60 min；TBST洗膜。 加入适当浓度的一抗孵育，4℃轻摇过夜。 TBST洗膜：加入适当浓度的结合HRP的二抗（1∶10 000至1∶30 000）及HRP?anti?biotin二抗（1∶5000）孵育，室温下轻摇60 min. ECL或ECL plus显影1 min后，在暗室中进行曝光2 s~15 min.

　　2结果

　　2.1积雪草酸对HSCT6细胞毒性不同浓度组与正常对照组比较，LDH释放率在30 μmol/L以下时无显著差异。 40 μmol/L以上时有差异（F=5.21， P%26lt;0.05， 图1）。

　　2.2积雪草酸对HSC?T6细胞的增殖不同浓度组与正常对照组比较，在30 μmol/L以下时，对细胞增殖无增加和抑制作用。 40 μmol/L以上时显著抑制细胞增殖（F=49.04， P%26lt;0.05）。

　　2.3TGF?β增加HSC?T6细胞I 型胶原蛋白表达的时间和剂量1 ng/mL TGF?β作用HSC?T6细胞24 h，Ⅰ型胶原蛋白表达水平最高。 不同剂量TGF?β作用HSC?T6细胞24 h，Ⅰ型胶原蛋白表达水平在1 ng/mL TGF?β组最高。

　　2.4积雪草酸减少HSC?T6细胞Ⅰ型胶原蛋白表达10～30 μmol/L的积雪草酸可以抑制TGF?β活化的HSC?T6细胞的Ⅰ型胶原蛋白表达。 溶解积雪草酸（20 μmol/L）组的等体积DMSO无抑制活化的HSC?T6细胞的Ⅰ型胶原蛋白表达作用。

　　3讨论

　　TGFβ是重要的致肝纤维化细胞因子之一。 当TGFβ刺激肝星状细胞时，肝星状细胞活化、转化为肌原成纤维细胞，分泌含有大量胶原蛋白的细胞外基质。 HSCT6细胞是经SV40大T抗原转化的大鼠肝星状细胞系，具有活化的肝星状细胞表型［3］。 为了确定HSC?T6细胞是否能够接受外源性TGFβ刺激，产生胶原蛋白表达的变化，不同剂量的TGFβ作用于HSCT6细胞，免疫印记检测Ⅰ型胶原蛋白的结果显示1 ng/mL TGFβ诱导HSCT6细胞胶原蛋白表达含量为最高。 以1 ng/mL TGFβ作用HSCT6细胞，检测不同时间HSC?T6细胞胶原蛋白表达含量，结果显示在24 h Ⅰ型胶原蛋白表达水平最高。 外源性TGFβ诱导HSC?T6细胞胶原蛋白表达的剂量和时间测定结果表明TGFβ可以刺激HSCT6细胞高表达Ⅰ型胶原蛋白，HSCT6细胞系可作为筛选治疗肝纤维化药物的细胞模型。

　　抑制肝纤维化可以通过抑制肝星状细胞（HSC）的增殖，促进HSC细胞的凋亡，上调TGF?β/Smad信号途径中的负反馈信号Smad7，以及减少抑制性组织金属蛋白酶（TIMP）等多种途径实现抑制细胞外基质（ECM）过度增生［4-5］。 10~30 μmol/L积雪草酸作用于TGF?β激活的HSC?T6细胞，可以有效抑制其Ⅰ型胶原蛋白表达水平。 在同样剂量范围内，积雪草酸对HSC?T6细胞的增殖无显著抑制作用，同时也没有显著的细胞毒性作用。 本研究表明积雪草酸抑制活化的HSC?T6细胞的Ⅰ型胶原蛋白表达与抑制HSC?T6细胞的增殖和积雪草酸产生的细胞毒性作用无关。 在我们的研究中有数据显示10~20 μmol/L 积雪草酸无明显地促进HSC?T6细胞凋亡作用，小于30 μmol/L积雪草酸对Ⅰ型胶原蛋白合成的抑制作用与积雪草酸诱导凋亡作用似乎无关。 积雪草酸抑制HSC?T6细胞Ⅰ型胶原蛋白合成与Smad2/3和Smad7以及TIMP分子之间的关系需进一步研究。

　　【参考文献】［1］Maquart FX， Wegrowski Y. Triterpenes from Centella asiatica stimulate extracellular matrix accumulation in rat experimental wounds［J］。 Eur J Dermatol，1999，9（4）：289-296.

　　［2］谢举临， 利天增， 祁少海，等。 积雪草甙对体外培养的成纤维细胞的作用［J］。 中山医科大学学报， 2001， 22（1）： 41-43.

　　［3］Silke Vogel， Roseann Piantedosi， Jorge Frank， et al. An immortalized rat liver stellate cell line （HSC?T6）： A new cell model for the study of retinoid metabolism in vitro［J］。 J Lipid Res， 2000， 41： 882-893.

　　［4］Bioaller R，Brenner DA. Liver Fibrosis［J］。 J Clin Invest， 2005，115：209-218.

　　［5］Friedmen SL. Mechanisms of hepatic fibrosis and therapeutic implications［J］。 Nature Clin Prac Gastroenterol Hepatol，2004，1：98-105.